Dicer ซึ่งมี dsRNA-specific endonuclease ที่สามารถจดจำและจับ dsRNA ที่มีความคล้ายคลึง (homologue) กับ mRNA เป้าหมาย จะตัดสาย dsRNA ออกเป็นสายสั้นๆ ที่เรียกว่า small interference RNA (siRNA) ที่มีความยาวประมาณ 21-25 คู่ จากนั้นArgonaute 2 จะเข้ามาจับ siRNA ดังกล่าวเกิดเป็น ribonucleoprotein complex (RNP) และเหนี่ยวนำให้โปรตีนชนิดอื่นเข้ามารวมกันเพื่อสร้างเป็น RNAi-silencing complex (RISC) RISC จะทำการแยก siRNA สายคู่ออกเป็นสายเดี่ยว โดยสายเดี่ยวที่เป็น antisense ของsiRNA จะมีลำดับเบสที่เป็นคู่สมกับ mRNA เป้าหมาย (sense) จึงเป็นตัวกำหนดความจำเพาะและการจดจำให้ RISC complex เข้าจับและทำลาย mRNA เป้าหมายได้อย่างแม่นยำ ซึ่งRISC ที่มี siRNA สายเดี่ยวรวมอยู่ด้วย (RISC complex) เข้าจับกับ mRNA เป้าหมายโดยอาศัยลำดับเบสคู่สมระหว่าง siRNA และ mRNA เป้าหมาย จากนั้น mRNA จะถูกย่อยโดย slicer ใน RISC complex

mRNA ที่ถูกย่อยจะถูกทำลาย เป็นผลให้ไม่มี mRNA ผ่านเข้าสู่กระบวนการแปลรหัสไปเป็นโปรตีน ทำให้ไม่มีการสร้างโปรตีนจากยีนนั้นเกิดขึ้น การทำงานของ RNAi จึงเป็น posttranscriptional regulation of gene expression หรือ posttranscriptional gene silencing